rokazyme生产和销售用于研究，诊断和工业测试目的的新型酶。该公司成立于2006年，是冰岛生物技术公司Prokaria的副产品，该公司后来合并为非营利性国有企业Matis。Prokazyme基于二十年的地热生物勘探，微生物基因组学和酶发现。Prokazyme（作为中小企业）与马蒂斯组成了一个研究联盟，并共同参与了由欧盟资助的一些研究项目。持续的研发和与Matis的战略联盟使Prokazyme有机会开发大量不断增长的嗜热细菌和病毒基因数据库，并继续开发新的*酶产品。

ThermoPhage™ Polynucleotide Kinase – Bacteriophage RM378

ThermoPhage™多核苷酸激酶 - 噬菌体RM378

ThermoPhage™多核苷酸激酶是一种新型的热活性激酶，在高温下催化DNA的5'磷酸化，是仅有可用的热稳定酶。 

ThermoPhage™多核苷酸激酶是一种新型的热活性激酶，在高温下催化DNA的5'磷酸化，是仅有可用的热稳定酶。该酶具有非常低的3'磷酸酶活性。Thermophage™多核苷酸激酶非常适合各种应用，包括核酸的放射性标记（Blondal等2005，J Biol Chem 280：5188-94）

提供500个单位和1000个单位（上面选择的产品）以及10x反应缓冲液。 

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产品：Pnk162S | 多核苷酸激酶500单位 | 价格：220.00 EUR

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产品：Pnk162L | 多核苷酸激酶1000单位 | 价格：320.00 EUR

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有关详细信息，请参阅下文或下载产品说明书

介绍：

ThermoPhageTM多核苷酸激酶（PNK）催化磷酸（Pi）从ATP的γ-位置转移到羟基化核酸（RNA或DNA，单链或双链）的5'末端或将Pi交换为单体。 - 磷酸化核酸（1）。ThermoPhageTM PNK来源于感染Rhodothermus marinus的噬菌体RM378（2）。从大肠杆菌中表达并纯化重组PNK蛋白。ThermoPhageTM PNK的适温度为60-70°C。对于短的孵育时间（1小时或更短），酶的适温度约为70°C，但对于更长的孵育方案，我们建议60-65°C。ThermoPhage PNK具有Mn2 +依赖性3'磷酸水解酶活性，不会干扰其5'激酶活性。

应用：

• 使用32P-γ-ATP标记核酸用于探针和DNA测序。

• 核酸的磷酸化用于随后的克隆连接。

• 用于连接酶反应的寡核苷酸的磷酸化，如连接酶链反应和类似程序（3-4）。

• 用修饰的磷酸（即硫醇 - 磷酸）对核酸进行磷酸化，用于随后的修饰和/或标记。

注意：   ThermoPhage PNK受高浓度（> 50 mM）盐浓度（KCl和NaCl）的抑制，并受到磷酸根离子和铵离子的强烈抑制。标记5'磷酸化核酸（交换反应）将在与正向反应相同的缓冲液中起作用，但需要更多的时间和酶。如果使用包括RNA和RNA酶抑制剂在内的方案，请确保它们在高温下有活性，例如SUPERase InTM（Ambion）或RNAse-Free核糖核酸酶抑制剂（CHIMERx）。

储存：
储存和稀释缓冲液：10mM Tris（pH 8），50mM KCl，0.1mM EDTA，0.1μMATP，1mM DTT和50％甘油。ThermoPhageTM PNK在-25至-15°C下储存可稳定一年。

单位定义的反应条件：
1x反应缓冲液（50mM MOPS（pH 8.5），1mM DTT，10mM MgCl 2,10mM KCl），2nmol ATP，25μg/ ml BSA，5％PEG6000,1nmol ssDNA寡核苷酸和ThermoPhageTM PNK酶在20μl体积中于70℃温育15分钟。

浓度和单位定义：
浓度25U /μl 
一个单位的ThermoPhageTM多核苷酸激酶催化在70℃下在30分钟内将1nmol的γ-磷酸从ATP转移到寡核苷酸的5'羟基化末端（5）。

应用协议：

反应方案：
对于优化的磷酸化反应方案，在25-50μl反应体积中使用10-20单位的酶与1x反应缓冲液，5％PEG6000,25μg/ ml BSA，10-100μMATP和底物。在60-70°C孵育1-2小时。
对于使用32P的标记反应，33P-γ标记的ATP使用10pmol标记的ATP，至少10pmol底物和10单位PNK，如上所述在其标准缓冲液中。在60-70°C孵育1-2小时。
如果进行交换5'激酶反应，则增加孵育时间和/或使用的酶量。

活性测定：
1x ThermoPhageTM PNK缓冲液，25μg/ ml BSA，2nmol ATP（ATP和32P-γ-ATP的混合物）和1nmol ssDNA 5'羟基化寡核苷酸寡聚物底物和20μl反应体积中的0.1-0.5单位PNK。在70℃温育15分钟后，通过在95℃加热5分钟终止反应，并将样品在DE81滤器上捕获并在250mM磷酸盐缓冲液中洗涤两次。然后将过滤器干燥并在液体闪烁计数器中计数放射性并测定磷酸盐的掺入。

特征：

温度稳定性：
ThermoPhageTM多核苷酸激酶在60°C时稳定，但在65-70°C的延长时间内开始失活。标准测定在50,60,65和70℃下进行，并且在0,30,60和120分钟时取样（图1）。

图1：在50-70℃下随时间的热稳定性。该酶在50-60℃下稳定，但在65-70℃的延长时间内开始松散活性。

温度宜：
ThermoPhage™多核苷酸激酶的适温度在60°C至70°C之间。我们建议70°C的孵育时间短（1小时）。如果孵育时间较长，我们建议在60°C温育。然而，如图2所示，对于更短的孵育时间，酶在高达90°C时显示出相对较高的活性。

图2：在标准测定条件下在给定温度下孵育1小时的ThermoPhageTM多核苷酸激酶的活性。

5'激酶活性：
在标准条件下用10μMATP（32P-γ-和未标记的ATP的混合物）和20μMdA20或rA20寡聚体和5％PEG6000测定ThermoPhage多核苷酸激酶。反应时间在70℃下在10μl反应体积中30分钟。加入终止溶液（95％甲酰胺20mM EDTA，0.05％溴酚蓝和0.05％二甲苯Cyanol FF）终止反应。样品在20％UREA-PAGE凝胶上电泳，干燥并放射自显影。

图3：标准条件下ssDNA（dA20）和RNA（rA20）的磷酸化。PAGE凝胶显示使用5单位ThermoPhage PNK酶在标记反应中*耗尽ATP。

3'磷酸水解酶活性：
ThermoPhageTM PNK在pH5-7时具有宜的3'磷酸水解酶活性，主要存在于Mn2 +中，如图4所示。主要底物是2'-3'cAMP，如图5所示。水解酶活性不应干扰ThermoPhageTM PNK的5'激酶反应。

图4： 2'-3'cAMP上ThermoPhageTM PNK 3'磷酸水解酶活性的pH曲线。

图5： ThermoPhage PNK和T4 PNK在100μM2'-3'cAMP，3'TMP和dA15-PO4-底物上的3'磷酸水解酶活性的比较。

质量控制：
如下所述测定每批ThermoPhageTM多核苷酸激酶的活性和污染活性。

缺乏DNA核酸内切酶：

• 将0.25μg超螺旋pBR322 DNA与增加量的ThermoPhageTM PNK在25μl反应中于37℃和64℃温育4小时。100U的ThermoPhageTM PNK显示pBR322 DNA的超螺旋结构没有松弛。

• 将0.25μgλ-DNA Eco RI / HindIII片段与ThermoPhageTM PNK在25μl反应中于37℃和64℃温育4小时。100U的ThermoPhageTM PNK显示没有改变条带图案。

不含核酸外切酶：将
增加量的ThermoPhageTM PNK在含有[3H] - 标记的DNA的50μl测试缓冲液中于37℃和64℃温育4小时。显示无外切核酸酶活性的酶量至少为200单位。

缺乏Rnases：
来自Ambion的RNaseAlertTM实验室测试试剂盒（目录号1964）用于根据制造商的方案检测RNase活性。在100单位ThermoPhageTM PNK孵育1小时后未检测到RNase活性。

参考文献：

• Sambrook，J.，Fritsch，EF和T.，M。（1989）Molecular cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY。

• Hjörleifsdottir，S。等。（2002）嗜热宿主生物的噬菌体RM 378 - 美国专li号6,492,161
•  

Blondal等人。（2005）来自噬菌体RM378的5'-多核苷酸激酶/ 3'-磷酸酶的表征-J Biol Chem 280：5188-94。

• Wu，DY＆Wallace，RB（1989）Genomics 4,560-569。

• Barringer，K。，et al。（1990）Gene 89,117-122。

• Richardson，CC（1965）Proc Natl Acad Sci USA 54,158-165。

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